熒光探針PCR試劑盒利用擴增過程中Taq酶的5’核酸外切酶活性切割與靶序列結(jié)合的寡核苷酸探針。該探針5’端標記熒光報告基團，3’端標記熒光淬滅基團并被磷酸化以防止探針在PCR過程中延伸。當引物延伸至寡核苷酸結(jié)合位置時，Taq酶可以將其切割成小片段，使報告基團和淬滅基團分開并發(fā)出熒光。
 

　　隨著PCR反應(yīng)的進行，每合成一條新的DNA鏈就會有一個對應(yīng)的探針被切斷并釋放熒光信號。通過檢測伴隨擴增產(chǎn)物增加過程中熒光強度的增長，從而實現(xiàn)對樣本中目的基因的定量分析。
 

　　熒光探針PCR試劑盒的測定步驟：
 

　　1.實驗前準備
 

　　-試劑與設(shè)備檢查：確認試劑盒完整性，包括Buffer、dNTPs、引物、酶等是否齊全；準備好專用的PCR儀和其他必要的實驗室設(shè)備，如移液器、離心管等。
 

　　-樣本處理：根據(jù)檢測目的采集合適的樣本(如血液、組織、分泌物等)，并進行適當?shù)念A(yù)處理，提取出高質(zhì)量的核酸用于后續(xù)實驗。對于冷凍保存的樣品，應(yīng)在冰浴上緩慢融化并充分混勻。

 

　　2.配制反應(yīng)體系
 

　　-按照說明書的要求，在無菌條件下準確量取適量的PCR反應(yīng)液、熒光探針、引物以及模板核酸等成分，加入到反應(yīng)管中。注意各組分的比例和體積要準確控制，以確保反應(yīng)的正常進行。
 

　　3.設(shè)置PCR程序
 

　　-根據(jù)目標基因或病原體的特點，在PCR儀上設(shè)置合適的擴增參數(shù)，包括變性溫度、退火溫度、延伸溫度、循環(huán)次數(shù)等。不同的檢測項目可能需要不同的程序參數(shù)，需嚴格按照說明書進行設(shè)定。
 

　　4.運行PCR反應(yīng)
 

　　-將配制好的反應(yīng)體系放入已設(shè)置好程序的PCR儀中，啟動儀器開始擴增反應(yīng)。在反應(yīng)過程中，PCR儀會根據(jù)設(shè)定的程序自動完成變性、退火和延伸等步驟，使目的基因得到大量復(fù)制。
 

　　5.數(shù)據(jù)采集與分析
 

　　-隨著PCR反應(yīng)的進行，熒光信號會逐漸增強。通過實時監(jiān)測熒光強度的變化，可以得到一條熒光擴增曲線。根據(jù)曲線的特征，如熒光背景信號階段、熒光信號指數(shù)擴增階段和平臺期等，來判斷檢測結(jié)果。可以使用專業(yè)的軟件對數(shù)據(jù)進行分析，確定樣本中是否存在目標核酸以及其濃度等信息。